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jan是几月基因工程大分子DNA的制备-生科实验教学中心

基因工程大分子DNA的制备-生科实验教学中心
DNA提取的目的
1、可用PCR从基因组中扩增基因。
2、作RAPD分析,区别两种物种之间的亲缘关系王屾 。
3、作Southern分析张角定理,检测是否转入基因;探测同源的基因家族的存在。
4、作酶切图谱,用于DNA测序。
5、用于构建DNA分子文库施艾敏。
一、实验目的掌握植物DNA提取的基本步骤
二 、基本原理
CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)清虚道君,是一种非离子去污剂,能溶解细胞膜和核膜蛋白,使核蛋白解聚,植物材料在 CTAB 的处理下, 结合 65℃ 水浴使细胞裂解、蛋白质变性、 DNA被释放出来 。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂,能使蛋白质变性,并使抽提液分相,因DNA水溶性很强贝通网 ,经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质叶峻雄,上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀。
CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出,因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热,且离心时温度不要低于15℃。
CTAB 与核酸形成复合物,此复合物在高盐(>0.7mM)浓度下可溶柳菲儿 ,并稳定存在,但在低盐浓度(0.1-0.5mM NaCl)下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀。
三 、CTAB提取缓冲液的经典配方

Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏;EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性;NaCl 提供一个高盐环境,使DNA充分溶解,存在于液相中;β-巯基乙醇是抗氧化剂拾杯水,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变谢欣怡,使酚容易去除;PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚,减少DNA中酚的污染;同时它也能和多糖结合,有效去除多糖刘成章简介。
多糖的去除: 高盐法:用乙醇沉淀时位面官商,在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl,高盐可溶解多糖。
(1)有效制备大分子DNA的方法主要考虑两个原则:
防止和抑制内源DNase对DNA的降解;
DNase 以Mg++Mn++为辅助因子,只要加入一定的螯合剂, 如EDTA 、柠檬酸(10-100mM)便可。
尽量减少对溶液中DNA的机械剪切力。动作轻柔、减少涡旋、使用大口吸管。
四、实验材料
小草
五、实验步骤
1.水浴(65℃)加热700ul CTAB buffer。
2.取1g小草叶片,将叶片置于研钵中绯梦之森,加入液氮三国兵锋,充分研磨至粉末状后白二少,转移到4个CTAB buffer (含2%V的β-Me,与粉末充分混匀(关键)大道长生。
3.65℃水浴混匀至细胞内容物泛白,中间温和混匀几次。
4.待混合物冷却至室温后亚当舒尔曼,加入等体积的氯仿/异戊醇(24/1),颠倒混和10min 左右(下深上淡)。
5.室温下8000r离心10min ,取上清。
6. 取上清,jan是几月加2/3 V 的异丙醇,混匀。
7.离心收集沉淀。
8.用1ml 70%乙醇洗涤2次以去除盐(可置-20 ℃冰箱过夜)。
9.倒去70%乙醇,37℃干燥七哥电影网,况复生(至边缘透明),溶于20μl TE缓冲液。
10.加入1μlRNase A(10mg/ml),37℃保温30min。
11.0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。
六、结果分析
提取的基因组DNA片段在20kb-30kb之间野人娘子。高质量的基因组DNA带型单一无拖尾现象。DNA纯度的检测
A260/280 约为1.8±1;
OD260/280此值应大于1.7,如果小于1.7,则说明含较多的蛋白;
OD260/235 应大于1.7,小于时含有小分子杂质。
浓度计算:
OD260DNA为50ug/ml,OD260x50x溶解体积/组织鲜重毛渝南。
琼脂糖凝胶电泳估计: